프로듀스48 7회 다운로드

프로테아제 기반의 번역 후 조절은 신속한 반응, 합성성 및 모듈성28,39에 많은 이점을 제공하지만 단백질 회로를 구성할 때 몇 가지 제한 사항도 고려해야 합니다. 첫 번째는 프로테오리시스와 관련된 ATP 비용입니다. 단백질 기판의 전개 및 전좌가 활발히 불리하기 때문에, ClpP 매개 프로테오리시스의 총 ATP 비용은 상대적으로 높을 수 있다. 예를 들어, 약 600개의 ATP가 모델 기판 티티I27 domain40의 분해에서 소비될 것이다. 제어 가능한 단백질 분해를 도입하여 발생하는 이러한 에너지 부담은 세포 증식 및 유전 회로 출력모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 단백질 회로의 설계 및 구현에서 인공 회로의 출력 강도를 미세 조정하여 세포내 자원 점유율을 감소시키는 데 필요하다39. 두 번째 제한사항은 큐잉 효과입니다. 여러 단백질이 분해되고 단백질 분해 자원을 위해 경쟁하도록 설계되면 ClpP 기계류가 과부하됩니다. 그 결과, 예기치 않은 큐링 커플링 반응이 발생할 수 있으며, 이는 표적 단백질 분해 속도를 감소시키고, 유전 적 부분의 타고난 파라미터에 영향을 미치고, 이어서 회로 output41의 프로파일을 변화시킬 것이다. 대기열 효과를 극복하기 위한 한 가지 유망한 전략은 메소플라즈마 플로럼 론 프로테아제 복합체와 같은 이종성 프로테오리시스 기계를 이용하는 것이다12. 기저성 항적기 개선 메커니즘을 조사하기 위해, aequorea 빅토리아로부터 pH 리포터, pHluorin이 표현되었다21. pHluorin 단백질을 함유하는 세포로부터 수득된 R410/470 값은 3 에서 8까지의 pH에 대한 이차관계를 나타내기 때문에 세포내 pH(in vivo pH)를 정량화하는데 사용될 수 있다(보충도 17). 균주 XN 이외에, 자일로스 탈수소효소를 함유한 양성 대조군 균주(XP)를 락토나아제 과발현없이 시공하였다(보충도 14).

도 7c에 도시된 바와 같이, XP와 비교하여, 자일로스 탈수소효소 및 락토나아제(XN 및 XO)와 공존하는 균주는 세포외 pH(in vitro pH)로부터의 결과에 따라 양호한 d-자일로네이트 생산 능력을 나타내었다. 더욱이, 단백질 발진기를 도입함으로써, 세포내 pH(in vivo pH) 항상성은 균주 XO에서 달성되었고, 이는 대조군 균주 XN의 그것과 비교하여 36시간 에서 2배 이상의 크기로 세포 생존능력의 관찰증가를 더욱 이끌었다(도 18). 마지막으로, 배양 조건이 최적화되었고, 13.11 g L-1의 d-자일로네이트 적시를 셰이커 플라스크에서 37°C에서 훌륭한 국물(TB) 배지를 사용하여 달성하였다(보충도 19). 이러한 조건하에서, 5L 공급 배치 배양에서 엔지니어링된 XO 균주의 결과는 가장 높은 d-자일로네이트 적시를 입증했으며 생산성은 각각 199.44 g L−1 및 7.12 g L−1 h-1에 도달할 수 있었다(도 7e). 요약하자면, pbO는 엔지니어링 된 세포 공장에서 신진 대사 이벤트를 정밀하게 제어하는 유리한 도구를 제공합니다.